人类大脑由数百亿个神经元构成，这些神经元通过电信号与化学信号传递信息，是思考、记忆、情感及行为等复杂功能的生理基础。然而，长期以来，科学界缺乏一种能够在无干扰条件下，同时对神经元结构、代谢及生化变化高分辨率观测的工具。传统荧光标记或基因编辑技术虽然功能强大，但往往会改变细胞原有的生理状态，且难以同步捕捉多种生理过程。因此，开发一种无需标记、多模态、高速成像的技术，已成为神经科学与生物医学成像领域的重要挑战。

图1.神经元微环境中的各种物理、代谢和生化变化[1]伊利诺伊大学香槟分校的Stephen Boppart团队提出了一种名为VAMPIRE的新型多模态光学显微镜系统，VAMPIRE全称为“Versatile Autofluorescence lifetime, Multiharmonic generation, Polarization-sensitive Interferometry, and Raman imaging in epi-detection”。该系统能够同步采集四种不同的物理与化学信号：散射光：探测细胞折射率变化，与电活动相关；双折射：表征细胞膜或纤维结构的取向变化；自发荧光：源自代谢辅因子NAD(P)H和FAD，评估细胞能量状态；拉曼散射：提供分子振动信息，解析局部生化环境。所有信号均源自同一激光光源激发，通过精密的光路设计与计算成像技术，实现了同步、高速、高分辨率的成像。

图2.VAMPIRE显微镜系统装置图[1]为实现上述多种信号的同步采集，VAMPIRE系统整合了多种成像模式，包括光学相干显微镜（OCM）、多谐波成像、偏振敏感干涉测量、自发荧光寿命成像（FLIM）以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像。系统采用钛宝石激光器作为激发光源，结合光子晶体光纤产生超连续谱，并利用傅里叶变换脉冲整形器在频域和时域调控斯托克斯光，实现多模态信号的同步采集与处理。图2展示了VAMPIRE显微镜的系统结构。其中，灰色光路代表光学相干显微镜模块。该模块基于低相干干涉原理，通过探测从样品不同深度返回的散射光之间的干涉信号，重建样品的微观结构。为实现高分辨率成像，系统要求光源具备较宽带宽。本系统采用钛宝石激光器作为激发光源，其中心波长为770 nm，重复频率为80 MHz。部分输出激光被耦合进入光子晶体光纤，产生带宽约200 nm的超连续谱。随后，一系列偏振分束器、二向色镜等光学元件将该光束分光与合束，最终导入线性扫描装置。在CARS成像模态中，绿色光路代表斯托克斯光，粉色光路代表泵浦光。将1.3 W、1045 nm的激光注入光子晶体光纤，可产生跨度达200 nm（基底宽度）的超连续谱。该系统采用定制设计的傅里叶变换脉冲整形器，该器件由衍射光栅与空间光调制器构成，能够独立调控斯托克斯光在不同波长下的振幅与相位，从而在维持飞秒脉冲宽度的同时保障光谱分辨率，该技术称为TOSS-CARS[2]。经整形后，斯托克斯光被调控至覆盖数个特定振动频率（如2830 cm¹, 2930 cm¹等），分别与泵浦光作用，实现对CH伸缩振动区等不同生化组分的特异性成像。此外，系统另一路770 nm飞秒激光用于激发FAD与NAD(P)H的自发荧光，并产生二次谐波信号。各成像模态通过精密配置的滤光片系统收集信号，各成像通道信号经滤光片系统有效分离，光谱重叠得以最小化，证明了系统光路设计的合理性。

图3.使用VAMPIRE显微镜拍摄的小鼠大脑皮层附近切片的图像[1]研究人员利用VAMPIRE系统对小鼠大脑皮层及视网膜切片成像（图3），展示了其在解析神经元微环境结构、代谢与生化特性方面的强大能力。例如，在脑切片中加入谷氨酸刺激后，系统成功捕捉到不同神经元集群的动态响应，并通过聚类分析识别出五种具有不同代谢响应模式的区域，进一步与CARS揭示的脂质/蛋白质比例相关联，体现了多模态成像在关联结构与功能方面的优势。

图4.VAMPIRE显微镜中单源同时检测的简化示意图[1]VAMPIRE显微镜作为一种新型无标记、高速、同步多模态光学成像平台，为解析神经元微环境提供了前所未有的多维信息，有助于深入理解神经活动及其背后的代谢机制，标志着向高通量光学生理学迈出了关键一步，未来有望广泛应用于神经科学、癌症生物学及临床前研究等领域。参考文献：[1] Iyer R R,Sorrells E J,Yang L, et al.Exploring the structure, metabolism, and biochemistry of the neuronal microenvironment label-free using fast simultaneous multimodal optical microscopy.Optica,2024,11(9):1352-1367.DOI:10.1364/OPTICA.532367.[2]Yang L,Iyer R R,Sorrells E J， et al.Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.Optics express,2024,32(7):11474-11490.DOI:10.1364/OE.517417.

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之五十一 快速同步多模式光学显微镜