多光子显微镜虽然可以提供快速、实时的组织学图像，但新鲜组织样品的放置和夹持一直是一个难点。如果想将多光子显微镜用于临床诊断，就需要将新鲜组织安装在诊断所需的标准方向上，这就更加困难。对于接触面积较小的样品，比如长条形的活检样品纵横比高，想要向下压平样品会使其翻倒或起皱，导致样品接触不均匀，评估不完整。为了解决这些问题，本篇文章介绍了一种基于活塞的样品夹持器，该夹持器能在样品表面实施一致均匀的压力，可以夹持各种形状和大小的样品来顺利完成多光子成像［1］。图1展示了基于活塞的样品夹持器。盖玻片粘到样品夹持器的底部，组织样品放置到盖玻片上方的槽里，柔性的橡胶膜被挡圈压在样品上。在橡胶膜和组织之间放置一条薄的纸芯，这种薄纸会吸走液体，减少组织和盖玻片之间的水隙。通过注射器给图1（B）橡胶膜上方封闭的空间充气，从而给橡胶膜提供均匀的压力来压紧组织。

图1 基于活塞的样品夹持器［1］

上述提到的穿刺活检样品，通常在条状方向上评估，接触面积相对于组织高度较小，很难对其施加均匀的压力。对此他们开发了一种支撑架来固定穿刺样品（图2）。如图2（B）中的情况1所示，接触面积小（厚度＜1 mm）的薄样品可以通过支撑架的侧面作为支撑，以实现在成像阶段竖立起来，支撑结构能将向下的压力重新分配为侧向力。如图2（B）中的情况2所示，对于接触面积相对较大、能够独立竖立在样品台上的组织，支撑结构可以防止组织被压碎。通过注射器注射空气的体积能控制膜形变，可以根据组织形状来调整注射空气的量，例如情况1注射大量空气实现更大的膜形变，情况2需要较低的压力，注射少量空气减少膜形变。

图2固定穿刺样品的支撑架［1］对新鲜切除的手术样品施加均匀的压力，组织会产生相反的张力导致组织边缘向上翘起折叠，从而无法完整评估组织（图3）。该文章提出给组织制造一些切口会破坏这种张力的传递，他们发现大致按照样品形状在表皮上进行简单的浅三角形切口相对有效（图3B）。

图3 组织松弛切割方案［1］

最后，他们利用设计的样品夹持器和支撑架结合双光子荧光成像评估了皮肤癌手术的切缘，发现通过对新鲜组织成像得到的真实切缘与医院常用的冰冻切片得到的切缘有差别，冰冻切片在切片过程中丢失的组织可能代表真正的手术边缘，组织的过度丢失可能会改变切缘状态，冰冻切片分析有一定概率误判组织的切缘。该文章提出的活塞式样品夹持器结合多光子显微镜，可以在无需切片的情况下直接对新鲜组织快速成像，评估肿瘤切除手术的真实切缘，提高切缘评估的准确性并降低使用冰冻切片时存在的假阳性率。

参考文献

［1］Huang， Chi Z．， et al． ＂Piston－based specimen holder for rapid surgical and biopsy specimen imaging．＂ Biomedical Optics Express 15．5 （2024）： 2898－2909．

原文标题 ： 多光子显微镜成像技术之四十五  用于手术和活检新鲜样品成像的活塞式样品夹持器