在癌症检测中，上皮组织发出的双光子激发荧光（TPEF）信号可以用于识别上皮细胞的形态功能变化。二倍频（SHG）信号主要显示细胞外的胶原蛋白结构，而三倍频（THG）可以清楚地显示癌症过程中细胞核的大小和形态，这些非线性光学显微镜的不同模态图像能为病理诊断提供重要的信息。本篇综述介绍了当前非线性光学显微镜图像的一些处理方法，如：真皮二次谐波自发荧光老化指数（SAAID）、肿瘤相关胶原特征（TACS）、快速傅立叶变换（FFT）分析和基于灰度共生矩阵（GLCM）的方法，这些方法被视为潜在的早期癌症检测诊断工具。

SAAID值可用来衡量组织中胶原蛋白和弹性蛋白的比率，SAAID指数定义为：SAAID=，其中I指的是每个信号的强度。由于基质主要由胶原蛋白和弹性纤维组成，胶原蛋白产生较强的二倍频信号，而弹性纤维产生自荧光，因此可以使用非线性光学信号来分辨肿瘤周围结缔组织区域的变化。当同时使用TPEF和SHG显微镜时，可以使用此参数进行图像分析。TACS方法是通过计算胶原纤维的角度（相对于肿瘤边界）来识别具有异常外观的上皮区，经常用于确定肿瘤间质边界处的胶原纤维方向。目前，有三种TACS可用于较好地表征肿瘤进展的特定阶段：TACS-1（在疾病早期，小肿瘤周围存在密集的胶原）、TACS-2（胶原纤维平行于肿瘤边界排列在0°左右）和TACS-3（当肿瘤侵袭时，胶原纤维垂直于肿瘤边界排列在90°左右）。FFT分析也是一种常用于确定胶原纤维取向的图像分析方法。对胶原纤维的图像进行FFT处理，对于随机取向的纤维，相应FFT图像的强度图看起来像一个圆；如果纤维完全对齐，圆将塌陷成一条线。因此，可以通过对FFT图像进行椭圆拟合来计算其短轴和长轴之间的比率，即其纵横比（AR）。当AR接近零时，样本将更加各向异性，而当AR接近1时，样本将更具各向同性。GLCM是分析图像纹理特征的方法，可以用于分析非线性光学显微图像的纹理，对鉴别病理和正常组织效果显著。灰度共生矩阵基于统计学原理，根据灰度图像中各个像素之间的距离和方向构造而成，算法使用了灰度图像中相隔一定距离的两个像素之间的空间相关特性。共生矩阵定义为灰度纹理图像中某一特定方向θ上相距为ｄ的两个灰度值同时出现的联合概率分布，其是像素距离ｄ和角度θ的矩阵函数。用灰度共生矩阵直接表述一幅图像的纹理分布情况并不直观。因此，需要对矩阵进行相应的数学变换，获得能直观表征图像纹理特征的参数，获得的参数中只有四个互不相关即能量、对比度、相关性、局部稳定性。能量，也称为角二阶矩(ASM)，是灰度共生矩阵中各元素的平方和，反应灰度图像中灰度值分布的均匀程度。对比度(CON)即惯性矩，表示整幅灰度图像中像素点与它相邻像素点灰度值之间的反差对比情况，反映图像的清晰度和纹理沟纹的深浅度。相关性(COR)，反映空间灰度共生矩阵元素在行或列方向上的相似程度，可以反映出图像局部灰度相关性，度量灰度图像纹理一致性和相似程度。局部稳定性即逆差矩(IDM)，是对图像纹理局部变化的度量，反映纹理的平滑度、清晰度和规则度。其中，相关性方法常应用于胶原SHG图像。

图1 对比四种非线性光学显微镜图像处理技术：SAAID、TACS、FFT和GLCM [1]

总之，该综述总结了四种非线性光学显微镜图像处理技术，这些技术结合复杂的动物模型和计算机辅助数据分析，将有助于早期肿瘤诊断和开发新的治疗策略。

参考文献：

[1] Adur et al. Nonlinear Optical Microscopy Signal Processing Strategies in Cancer. Cancer Informatics 2014:13 67–76 doi: 10.4137/CIN.S12419.

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之三十二 面向癌症诊断的非线性光学显微镜的图像处理方法