无标记、非破坏分子成像避免了标记对分子性质的影响，这一特点使其在生物医学领域有着重要应用。目前，受激拉曼显微镜（SRS）、相干反斯托克斯拉曼显微镜（CARS）以及光声显微镜（PA）已被使用在多种病理学相关研究之中。由于水吸收和组织散射的问题，SRS和CARS显微镜成像深度被限制在数百微米，为了增加成像深度，相关学者提出的PA显微镜，但又无法同时兼顾高空间分辨率。本篇文章利用短波红外（SWIR）激发的光热（PT）效应实现成像，同时满足了毫米级成像深度和微米级分辨率，并且和已有成像方法做对比，得到了较好的结果[1]。

图1.光热显微镜探测原理及装置图[1]

光热成像的激发原理如图1.（a）所示，分子吸收单个光子之后产生热效应，改变局部折射率；图1（b）为装置图，激发光采用中心波长为1725 nm的脉冲激光，对应C-H键第一级的谐波吸收峰，探测光为中心波长位于1310 nm的连续激光。这两束光经由双色镜空间合束后聚焦到样品中，以实现源自吸收诱导的光热效应。光热成像的探测原理如图1.（c）所示：激发光作用在样本上导致吸收点折射率变化，之后收集探测光传播的改变作为观测信号。

图2.光热显微镜对聚苯乙烯小球成像结果[1]

用上述装置对聚苯乙烯小球成像来计算PT显微镜的分辨率，结果如图2.（a）所示。小球直径是500 nm，分别对xy和yz界面成像并计算信噪比，之后计算信号强度的半高宽和小球的轮廓卷积得到了系统的横向分辨率为0.77 µm、轴向分辨率为3.5 µm，验证该显微镜具有µm级的分辨率。

图3.光热显微镜（上）和受激拉曼显微镜（下）成像对比[1]

把聚苯乙烯小球置于不同浓度的内毒素水溶液中，该溶液模拟了生物组织的真实环境，包括吸收和散射。用PT显微镜和SRS显微镜分别对这些溶液成像，结果如图3所示。从左到右溶液浓度越来越高，对应散射和吸收效应越来越强。可以明显观察到，PT显微镜在散射和吸收的作用越来越强时，信噪比下降的比较缓慢，在溶液浓度5%和10%的情况下，光热显微镜的成像结果明显优于SRS显微镜，当在真实生物组织中，其穿透深度可以达到1 mm。

图4.对真实细胞中脂质三维成像。未去除水背景（上）和去除水背景（下）[1]

癌症的诱导原因和细胞中脂质成分的变化有着密切的联系，所以对脂质的成像十分重要。图4中上面一层为直接得出未去除水背景信号的结果，下面一层为利用脂质和水不同的热衰减系数去除了噪声的影响得到的分布图。之后通过调节穿透深度，得到了整个细胞中脂质分布的三维结构，这在研究癌症相关的病理过程中至关重要。本项工作提出了一种基于光热原理的新型成像方法，可以同时实现1毫米的穿透深度以及亚微米级的分辨率。通过和已有的SRS显微镜作为比，证实了其在真实的生物组织中优于其他成像方法。参考文献：[1] Ni, H., Yuan, Y., Li, M. et al. Millimetre-deep micrometre-resolution vibrational imaging by shortwave infrared photothermal microscopy. Nat. Photon. 18, 944–951 (2024).

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十七    大深度、高分辨率光热显微镜