结合了相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）、二倍频（SHG）和双光子荧光成像的多模态非线性显微镜可以无标记地提供组织结构及分子组分信息，进行高灵敏度高特异性的疾病诊断，在临床在体医学成像有广泛的应用。但是，这种技术实现临床应用需要：（1）性能稳定且参数适当的超快光源；（2）低损耗不畸变的的激发光传输及信号收集；（3）高度集成且高速精准的扫描系统；（4）高性能内窥物镜。文章［1］介绍了一台以四波混频光纤激光器为光源的多模态非线性显微内窥镜系统，系统装置图见图1。

图1 多模态非线性显微镜系统示意图 ［1］

系统驱动光源为掺镱光纤激光器，产生波长1030nm、脉宽60ps、重频1MHz、平均功率100mW的Stokes光；泵浦光波长795nm，脉宽20ps，由Stokes光通过单模光纤中的四波混频产生。光源后用滤波器滤出了所需的Stokes光及泵浦光，双色镜DC2用于分离反向收集的信号光，衍射光栅G与其后透镜组合将不同波长的激发光在空间上分离，耦合进入两个纤芯。系统用于传输的是1m长的单模双纤芯双包层（DCDC）纯硅纤芯光纤，光纤结构见图2。用纯二氧化硅纤芯可以去除掉自发荧光背景。为了保证低损耗并尽量减少光纤传输过程中四波混频带来的背景噪声，两种波长的光分别在独立的两个纤芯中单模传播。两纤芯间隔48μm，一个芯直径4．8μm，截止波长在836nm，用于传输泵浦光，另一个芯直径6．3μm，截止波长970nm，用于传输Stokes光。作者采用双包层光纤来同时进行传输激发光及收集信号光，内包层直径60μm，外包层直径125μm。图2b为各个波长在光纤中的损耗曲线，Stokes光、泵浦光以及400nm－700nm范围内的信号光在光纤中对应部分的损耗都极小。

图2 DCDC光纤结构及性能示意图 ［1］

DCDC光纤可实现以1fps帧速度、视场为180μm的螺旋压电扫描。光束经由一个梯度折射率透镜进行准直以减少波前畸变，再用衍射光栅和透镜组合使Stokes光和泵浦光在样品上实现角度及空间位置的重合。最终这个集成化物镜的工作距离为30微米，浸润介质是水，NA为0．55。整体的扫描器和物镜集成在一个直径2．4mm、长度39mm的不锈钢管探头中，探头到驱动器的所有连接线及光纤都包裹在医用内窥管中。扫描及物镜的集成结构见图3，系统可以实现近衍射极限的成像。图3d展示了对应于光栅第1，2衍射级，外包层能够收集95％的SHG信号、88％的双光子信号和81％的CARS信号。

图3 集成化内窥物镜结构及性能示意图 ［1］

测试显示系统可以分辨870nm间隔的两个珠子，具有亚细胞空间分辨率，为了提高成像质量，作者进行了10帧成像的平均处理。作者用该系统对生物样品进行成像，证明该系统具有细胞分辨率并可以对分辨细胞核，且与激光扫描显微镜成像结果进行了对比，验证了系统对生物组织成像的可信度。

图4 系统显微成像性能测试 ［1］

总而言之，这个全光纤结构的多模态非线性内窥显微镜系统在1fps帧速度的情况下可以实现亚微米空间分辨率，从激光到样品的传输率高达65％，在常规临床体内诊断和手术指导成像方面具有潜在应用前景。

参考文献：

［1］ Pshenay－Severin， E．， Bae， H．， Reichwald， K． et al． Multimodal nonlinear endomicroscopic imaging probe using a double－core double－clad fiber and focus－combining micro－optical concept． Light Sci Appl 10， 207 （2021）．

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之十九 基于双芯双包层光纤和微光器件的多模态多光子内窥成像