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光学显微成像的黄金十年已过?

导读: 如果06年PALM/STORM技术提出作为显微成像的起始点,当然STED和SIM技术要更早,还有其它的单分子技术如FRET和光镊,磁镊,膜片箝。

  21世纪的前十几年感觉像沧桑的几十年,纵观国内局势,经济突飞猛进,科技产出改头换面,腐败恶性扩增,人才引见大跃进式发展。放眼国际也是风云变幻,经济危机阴魂不散,地区冲突从不间断。本世纪的前几年,结构生物学还是大热点,02年的Wuthrich因液态核磁共振解析蛋白结构的技术获诺贝尔奖,03年的Mackinnon和Agre因为离子通道结构得了诺贝尔奖,06年斯坦福的Kornberg因为转录分子复合体得了诺贝尔奖,09年Steitz,Ramakrishna和Yonath因为核糖体结构拿了诺贝尔奖,12年斯坦福的Kobilka因为GPCR膜蛋白结构得了诺贝尔奖,所以中国在08年之后引进了很多结构生物学出身的人才,结构生物学的结果在被review的时候能被argue的弱点很少,只要你解出的是重要的蛋白,结果就在那明摆着,你有什么质疑的地方呢?结构对于解释生物功能和药物设计非常重要,而且每一个重要蛋白或复合体的结构都要花费很多的精力和财力。Oregon的EricGouaux手下的一个博士生花了9年才解出来一个膜蛋白毕业,你想如果一个人毅力不是那么强,第8年的时候放弃了,就啥也没有了。加州理工的Hoelz做核孔复合体结构用了大概20年,今年才刚解出来这个结构,发了一篇Science,他们每升细胞才能提取毫克级蛋白,准备样品都是拿50升的发酵罐养细胞才能拿到足够多的蛋白。看看UCSF最近很牛做低温电镜的YifanCheng,做了19年博士后才熬到那个位置,任何一个漂亮的故事背后都是数不尽的心酸。我见过的一些做工程的人一般对生物学的人评价就是你们总能发CNS,但请想想做生物的人基数是工程类人的100倍,一万个人里面也就一个能发CNS,绝大多数人都是炮灰。实际生物是最苦的专业,工业机会很少,学术的机会挤破头。倒是那些从其它领域第三者插足到生物领域的搞得都风声水起,比如华人里的SunnyXie,XiaoweiZhuang,MichelleWang,还有一些做结构和脑神经的要不就是工程出身,要不就是物理出身,要不就是化学出身,纯生物感觉啥也做不了。显微成像领域是第三者插足到生物领域最近比较突出的例子,为此三人拿了去年化学的诺贝尔奖,EricBetzig牛逼得不行,因为此人最近又搞了一个latticelightsheetmicrioscopy。他自己说这个lattice平面光显微镜比他得诺贝尔奖的超分辨率成像工作更有意义,他更喜欢自己最近的发明的技术,他还说现在谁还用confocal作活细胞成像谁就stupid,Confocal成像就是一个高损伤的高斯光在样品上滋滋地扫瞄,荧光分子利用率极低,他的lattice平面光技术秒杀共聚焦。

  如果06年PALM/STORM技术提出作为显微成像的起始点,当然STED和SIM技术要更早,还有其它的单分子技术如FRET和光镊,磁镊,膜片箝。到14年这些技术拿到诺贝尔奖,接近10年的黄金期基本就结束了,后面的工作就是应用,而且最重要和容易上手的应用工作这些前期开发者们都做得差不多了。当然他们写文章的时候还会说这些技术怎么怎么无敌,什么什么的可以干,实际局限都是一大堆。Lattice平面光显微镜貌似还有很多东西可以做,现在开始做这个还不晚,再过几年Zeiss的商品化产品出来,是人都可以买,那时候就不好说了,伯克利也只有一个实验室正在搭建Xavier,UCSF有一个实验室已经有了。大家像群峰一样呼搭呼搭冲上去,5年之内就把他做烂了。就跟我们去哪旅游一样,一旦对国内开发,基本就是很快被群殴。为什么我觉得黄金期要过呢?显微镜从样品制备到数据处理,我们可以perturb的一共就几个step:(1):样品制备。最近有个expansionmicroscopy技术,那个技术就是把你的样品泡大,一个纳米的东西变大到10纳米,所以分辨率提高10倍。PALM/STORM也需要在样品制备上作些处理,需要可以photoswitchable的荧光标记。(2):激发光路。荧光显微镜当然需要激发光,当然在光源上是用LED,激光,或者其它光源这些本质不会带来任何改变。最终光在光源出来后经过一堆透镜,滤光镜,扫瞄振镜等把光打到样品,一般最后都是通过物镜聚焦光到样品上。在激发光路上,所有的lightsheetmicroscopy或者叫planilluminationmicroscopy就是因为激发物镜与光采集物镜分开。比如Confocal,TIRF,PALM/STORM,SIM,STED都是用同一个物镜激发样品同一个物镜采集样品放出的荧光。在PLAM/STORM里面,photoactivation和荧光激活需要打开不同的激光,激发的瞬时开关还要控制一下。(3):采集光路。采集光路变数很小,采集光路越端,光学元件越少,信噪比越高。现在能变就是用什么照相机,比如confocal用光电二级管,PALM/STORM一般用EMCCD,而lightsheetmicroscopy一般都是sCMOS照相机,EMCCD光子率高一点,sCMOS成像速度快一些,lightsheet显微镜讲究的就是快,所以肯定要用sCMOS.Yildiz发明的FIONA技术也是快速追逐分子马达的运动,凡是涉及快速成像的肯定是sCMOS.(4):图像处理。PALM/STORM技术对每个荧光分子的PSF做高斯fitting,三维PALM/STORM就是elliptical高斯方程fitting.在此技术上如salk研究所的CangHu提出了什么云计算和贝叶斯统计等算法,HuangBo的Compressedsensing等,都是锦上添花不会伤筋动骨。SIM成像主要就是靠算法,傅里叶平面的信息整合。仔细看看整个光学成像能够被提高的地方基本都做到了最好,当然总有边边角角还可以做,什么双光子啊,各种平面光啊如airybeam啊,新统计算法啊,整合超分辨和其它单分子技术啊,用一个物镜还是两个三个物镜啊(注意,不是简单的就放几个物镜,每个物镜采集到的信息要整合,需要很多编程的工作,而且几个物镜的光学alignment还是很难的),多色成像啊,做单分子tracking啊,做出新的荧光分子啊如更小的quantundot啊,不用激活的染料啊,总之大的突破我觉得到头了,因此光学成像的十年黄金期已经快过去了。

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