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活细胞成像犀利武器之超高分辨率显微镜

导读: 超高分辨率显微镜赋予了人们突破衍射极限的能力,研究者们在这一技术的帮助下已经获得了许多固定样本的漂亮图像。

       超高分辨率显微镜赋予了人们突破衍射极限的能力,研究者们在这一技术的帮助下已经获得了许多固定样本的漂亮图像。不过,用超高分辨率显微镜进行活细胞成像,将是一个更大的挑战。目前市场上可以进行活细胞成像的超高分辨率显微镜主要有以下几种:

  以共聚焦为基础的系统

  徕卡公司的超高分辨率共聚焦技术已经走过了10年历史,其最新的超高分辨率系统TCSSP8STED3X,进一步优化了STED技术(StimulatedEmissionDepletion,受激发射损耗),并将其与最新的共聚焦平台SP8相结合。STED技术采用了两束同心重叠的激光(面包圈状),激发激光和损耗激光。激发光负责激发荧光基团,而损耗激光使激发激光的光斑外围进入基态(非淬灭)。这样的技术大大减少了激发光斑的面积,突破了光学衍射极限,使分辨率大大提高。“STED系统的成像速度非常快而且是纯光学的,”徕卡显微系统公司的STED应用开发者WernherFouquet解释道,“激光扫描的光斑非常小,突破了光学衍射的限制。此外,研究人员还可以分别调节X,Y,Z方向的超高分辨率水平,最低可达30nm。”(光学衍射极限的分辨率通常为200nm左右。)TCSSP8STED3X系统的门控技术(GatingTechnology)同样引人瞩目,该技术允许用户精确控制荧光检测的时间窗口范围。这意味着成像所需的激光能量更低,不仅有利于活细胞实验,也能很好地解决杂散光、自发荧光等的干扰。STED3X在活细胞成像方面的另一个优势是,可以对全光谱成像,支持使用橙色,红色,深红色等多种荧光素。正是在这些技术的帮助下,人们才能对囊泡活动进行超高分辨率的活细胞观察。

  上个月,蔡司公司发布了一款激光扫描的共聚焦显微镜——LSM880,该系统独特之处在于配备了专利的Airyscan检测器。

  传统的共聚焦显微镜通过针孔来阻止非焦平面的发射光(也称为airydisk)。LSM880的不同之处在于,Airyscan检测器不在针孔处限制光通量,而是直接用一个32通道的六边形平面探测器收集所有发射光,其中每个探测器元件都是有效的单个针孔。这一技术的使用,使LSM880的总体分辨率增加了1.7倍。(点击查看蔡司的video)

  “Airyscan技术的美妙之处在于,利用了传统共聚焦显微镜中被针孔阻断的光,在此基础上实现超越衍射极限的超高分辨率成像,”蔡司公司的JosephHuff说。

  拥有Airyscan技术的LSM880,可以支持任何类型的活细胞研究,Huff说。“你可以把这个系统用在倒置或正置显微镜上对细胞培养物进行超高分辨率成像,也可以对来自体内的组织进行成像。”此外,LSM880系统还能用来检测活细胞内的快速事件,以高达每秒13帧的速率进行拍摄。

  根据相关介绍,Airyscan技术在成像时可以达到140nm的横向分辨率和400nm的轴向分辨率。

  以SIM技术为基础的系统

  SIM也可以用来研究活细胞,举例来说,尼康公司的N-SIM系统就是专门为活细胞超高分辨率成像而设计的。所有基于SIM技术的仪器(包括N-SIM在内),都是通过特殊的照明模式(栅格移动)产生干涉图案(摩尔纹现象),这些干涉图案包含了样本的结构信息。

  要获得超高分辨率图像,通常需要采集大量不同Z轴的干涉图案,但尼康的N-SIM软件只需要一组Z轴干涉图案。“对于活细胞成像而言,一个焦平面数据就能有效地获得最大的时间分辨率”,Nikon超高分辨率产品经理ChrisO’Connell说。

  尼康系统的另一个优势是,使用了全内反射结构照明(TIRF-SIM)来提高样品表面的空间分辨率。“通过将入射光置于全内反射区域,我们获得了非常棒的图案,分辨率也得到了相应的提升至85nm,”O’Connell说。

  GE公司的DeltaVisonOMX也是一款以SIM技术为基础的系统,其特色在于三维SIM。该系统通过Blaze模块来获得更高的时间分辨率,能以1微米/秒的速度获得活细胞的3D-SIM图像。“通过三个激光束干涉来获得样品的3D-SIM图像”,GE公司细胞成像与分析部的科研主管PaulGoodwin解释道。DeltaVisonOMX使用galvanometers和一套光学镜组来实现对照明模式的控制。

  在宽场或TIRF模式下,DeltaVisionOMX最多可提供四个单独的相机,同时对不同荧光成像。“这些相机的成像速度都达到了大约200fps,能为用户提供大量的动态信息,”Goodwin说。另外,TIRF和photokinetic选配模块使用来自耶鲁大学的专利技术,将ring-TIRF与快速光漂泊/光活化整合起来。这样能够实现大视野的均匀TIRF照明,减少single-pointTIRF中常见的假象(artifacts)。据Goodwin介绍,GE的这一系统的分辨率最高可达几十纳米。

  样品制备的重要性样品质量对于超高分辨率显微镜而言特别重要,这一点与传统显微成像是一致的。在初次涉足超高分辨率成像时,之前的显微镜使用经历将会为你提供很大的帮助。“如果你不知道怎样通过传统显微镜获得最佳图像,那么超高分辨率显微镜也会令你感到头疼,”Goodwin说。“显微成像技术很难克服样本制备出现的问题。”

  首先我们必须认识到,样本是整个成像系统不可分割的一部分,Goodwin指出。“如果你没有控制好样本,显微镜再好也没有用……我常常对学生们说,如果你做不好普通分辨率的成像,那也应付不了超高分辨率。”

  O’Connell指出,在样本制备时注意细节并遵照最优方案是至关重要的。“你会惊讶于有那么多人拿着错误厚度的盖玻片来参加研讨会,”他说。尼康的光学系统是为#1.5玻璃盖玻片(约0.17mm厚)设计的,但他经常看到研究者们试图使用#1(0.15mm)甚至#0(0.1mm)玻璃盖玻片,这显然会降低成像的质量。“对于超高分辨率成像而言,这样的细节显得特别关键,”他说。“如果样本制备正确,一般就很容易得到漂亮的超高分辨率图象。”
 

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